Novo Curso: imunohistoquímica (IHC)

Essa semana aprendi uma técnica nova, imunohistoquímica. Bom mas o que significa isso?
Quando você vai ao médico e ele encontra alguma coisa estranha no seu corpo, como um nódulo por exemplo, você é submetido a uma biopsia, onde um pedaço desse nódulo é removido e depois de umas 2 a 3 semanas você tem o resultado, que vai dizer o que seria esse nódulo, se é maligno ou benigno.
Vocês já se perguntaram o que acontece nesse meio tempo? Como o médico sabe que é maligno ou benigno?

Vou lhes contar o segredo:

O pedaço de tecido retirado é colocado em formal e levado a um laboratório de patologia geralmente. Patologia é a ciência que estuda e dignostica as doenças (pato=doença, logia= estudo) através do exame dos tecidos, orgãos, fluidos do corpo.

Lá nesse laboratório, o tecido terá toda a água removida para que no final ele seja preencido por parafina, e como vocês sabem, parafina não se mistura com água. Através de diversas imersões em álcool em concentrações crescentes, a água é removida e substituída por álcool, depois faz-se imersão em xilol, um composto orgânico hidrofóbico (ou seja, que não se mistura com água). Assim o tecido fica pronto para ser imerso em parafina líquida,  levemente aquecida para não danificar o tecido, mas ainda permitindo que ela fica líquida.
O tecido fica num suporte, como uma pequena forma de bolo, que chamarei de cassete, que é preenchida com parafina. Coloca-se o cassete para esfriar numa placa gelada e assim a parafica endurece prendendo o tecido no meio.

Em seguida, o cassete contendo o tecido será levado para uma máquina, chamada de micrótomo, que cortará esse pedacinho de tecido em finíssimas fatias com espessura de 5 micrometro, ou seja, 5/1000000 metros. Cada pedacinho é colocado numa lâmina de vidro. Para tudo isso tem vários truques e segredos e até parece fácil quando você vê alguem fazendo, mas quando eu comecei a fazer....totalmente sem habilidade!! hahahahah Perdi vários pedaços. Há vários truquezinho que estou aprendendo com o tempo.

Veja o bloco de parafina preso na máquina, nele contem o tecido a ser contado. Na mão da pessoa tem uma fatia bem fininha de parfina com o tecido.

Depois das fatias de tecido estarem bonitinhas em cima do vidro, sem nenhum amassado, sem nenhuma quebra (imaginem que o pedaço é tão fino, tão fino, que qualquer coisa o faz voar, qualquer coisa o faz quebrar, e eu com minha delicadeza de elefante...sem comentários né!), é hora de corá-los para podermos visualisá-los melhor ao microscópio e identificar marcadores de doenças. As fatias tem que ser finas para a luz do microscópio conseguir atravessar e vc visualizar, se a fatia fosse espessa, bloquearia toda a luz, e você veria uma sombra negra!

Os corantes são hidrofílicos, ou seja, tem afinidade por água e não por compostos hidrofóbicos, como a parafina. Portanto, inicia-se um processe de remoção da parafina. Primeiro xilol por 3 vezes, depois alcool 100% por 2 vezes, alcool 96% e metanol com água oxigenada (peróxido de hidrogênio) para remover qualquer atividade das enzimas peroxidade (vocês vão ver porque no final).

Agora só há o tecido em cima do vidro, e magicamente ele não cai de lá! rs, não é mágica não é ciência!

Só uma restrospectiva das nossas primeiras aulas de ciência na escola. Nosso corpo é composto de células, toda tem o mesmo DNA certo? E porque então não somos uma massa de células iguais? Por que o fígado é diferente do coração, que é diferente dos olhos, da língua, dos pés? Isso me fascina!! É por isso que entrei na ciência! Como pode todas as células do nosso corpo ter o mesmo DNA e elas serem tão diferente de uma tecido para o outro, mas serem semelhantes dentro do mesmo tecido. Bom, a resposta é bem longa, vai um curso de embriologia, de genética e biologia molecular para explicar. Mas resumindo rusticamente, cada tecido expressa o mesmo DNA de diferentes formas, trocando em miúdos, cada tecido produz diferentes proteínas, em quantidades diferentes, o que os deixa diferente um do outro, por exemplo o tecido muscular, que tem que dar força e movimento tem bastante proteína miosina e actina, já as células do pâncreas produzem os hormônios isulina, por exemplo. Agora o que faz cada tecido produzir diferentes proteínas, é a coisa mais linda do mundo, é tão complexo e perfeito que não dá para explicar e, claro, ainda não tem total explicação!
Assim, cada tecido tem suas características gerais, e qualquer coisa que foge a esse padrão é considerado patológico, em diferentes níveis.

Agora como ver as proteínas em um tecido? Proteínas são moléculas pequenas que não se pode ver no microscópio, então como "ver" uma proteína? A ideia é ligar alguma coisa maior, que possamos ver no microscópio. Ai que entra a imunohistoquímica,  imuno, que vem de sistema imune, sistema de defesa do nosso corpo contra bacterias, virus, etc, histo, que significa tecido e química, devido as reações quimicas no final do processo.

Vamos tomar como exemplo a proteína IKK de humanos, envolvida no processo inflamatório. Alguém algum momento produziu, purificou essa proteína em laboratório. Essa proteína purificada é então injetada em um animal , que não humano, como o coelho, induzindo a produção de anticorpos, pois o coelho não produz a IKK própria de humanos, certo? Essa proteína humana é, portatanto,  um antígeno no corpo do coelho, logo, seu sistema imune vai combatê-la produzindo anticorpos. Em seguida, do sangue do coelho são purificados os anticorpos contra a nossa proteína. Ai já temos alguma coisa que se liga a nossa proteína, mas se colocarmos o anticorpo na nossa fatia de tecido da biopsia, ainda não veremos.

Há dois métodos de visualização da proteína no tecido: o direto, onde a esse anticorpo primário é ligado  um corante ou um composto fluorescente, ou o método indereto, que usa um anticorpo secundário que tem um enzima ou um corante ligado.
Para isso, então é produzido um segundo anticorpo, denominado anticorpo secundário, contra o anticorpo primário. Os anticorpos do coelho que purificamos são injetados  em outro animal como a cabra, ovelha, ou rato, esses animais vão produzir outros anticorpos para combater esses novos antígenos.

Por alguma maneira que eu não sei como, nesse anticorpo secundário (ou no primário, no método direto) é ligado uma enzima cuja reação catalisada libera algum produto colorido ou fluorescente. Geralmente a enzima usada é HRP, uma peroxidase. Então em nosso experimento, que queremos ver a proteína IKK, nós colocamos um anticorpo primário que se ligará a nossa proteína, em seguida, colocamos nosso anticorpo secundário, que se ligará ao anticorpo primário previamente ligado ao nosso alvo, e por fim colocamos o peróxido de hidrogênio e o DAB, este último é reduzido em presença de peróxido de hidrogênio resultando na deposição de um precipitado marroma se resultando sobre a proteína que se quer visualizar, e assim conseguimos ver ao microscópio, onde estiver marrom, lá está sua proteína! Espetacular não é?

Método direto de detecção da protein. Proteína alvo, chamada aqui de A, que está na superfície da célula é reconhecida pelo anticorpo primário que já contem um composto fluorescente ou colorido aderido.

Método indireto. Proteína A é reconhecida pelo anticorpo primário que foi produzido em coelho. Em seguida esse anticorpo é reconhecido pelo anticorpo secundário, em vermelho, que foi produzido em cabra. Esse anticorpo secundário possui o composto fluorescente ou colorido, ou ainda uma enzima

Esse é o resultado final. Aqui é um tecido de câncer de mama, que foi corado para proteína IKK, em marrom (figura da esquerda). A figura da direita é o controle, sem nenhuma coloração marrom. (www.cellsignal.com)

Para saber se a pessoa tem câncer, entre outras coisas, é possível fazer imunohistoquímica para uma proteína que só tem no câncer, ou uma que só tem em um tecido normal.

Bom, nesse curso cheguei até a esse última figura, aprendi a cortar, a corar, a identificar estruturas no tecido. Foi bem legal. Quem deu o curso foi o técnico do Departamento de Patologia, Chris van der Loos, um cara que trabalha desde 1984 com imunohistoquímica, e sabe muito. Ele acompanho e participou do desenvolvimento da técnica, tem vários artigos científicos sobre o assunto. E essa curso ele dá em vários lugares, cobrando 700 euros, mas para nós duas, eu e minha chefe, além de ter sido um curso particular, só nós duas, foi de graça, cortesia, e ainda obtivemos resultados. 

É para isso que estou aqui, para aprender tudo que for possível!!

Espero que tenha consiguido explicar de uma maneira que vocês possam entender!